抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因转化拟南芥的初步研究
抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因转化拟南芥的初步研究
【摘要】 目的: 建立能表达抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的转基因植株, 为汉坦病毒基因工程抗体的研究提供实验基础。方法: 将构建的含抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的植物抗体表达质粒3G1MHpCAMBIA2301, 用TSS冻融法导入农杆菌GV3101, 利用农杆菌介导的抽真空转基因技术转化野生型拟南芥,获得转基因植株。用PCR、 Northern blot检测转基因植株。结果: 经PCR分析表明, 拟南芥的基因组中有抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因整合, 并成功获得7株T0代转基因拟南芥。植株提取RNA, 经Northern blot分析可见约1500 bp及800 bp处的目的条带, 为编码重、 轻链的目的基因。结论: 成功地构建了含抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的拟南芥植株, 为进一步利用植物表达治疗性抗体奠定了基础。
【关键词】 汉滩病毒 嵌合抗体 转基因植物 植物抗体
Transformation of fulllength gene of mouse/human chimeric antibody against Hantaan virus into Arabidopsis thaliana
ZHOU Wei, WU Xingan*, LUO Wen, HU Gang, ZHANG Fanglin, BAI Wentao, ZHANG Liang, YU Lan, SHI Mengyuan, XU Zhikai
Department of Microbiology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; Department of Life Science, Xi’an University of Arts and Science, Xi’an 710065, China
[Abstract] AIM: To construct the transgenic Arabidopsis thaliana containing fulllength gene of mouse/human chimeric antibody(3G1MH) against Hantaan virus. METHODS: The recombinant plasmid 3G1MHpCAMBIA2301 was transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101 by TSS freezethaw method, and then the recombinant was transferred into wild Arabidopsis thaliana by vacuumtransgenic method. The regenerated transgenic plants were selected with kanamycin, and confirmed by PCR and Northern blot. RESULTS: PCR result showed stable integration of the 3G1MH gene IN Arabidopsis thaliana genome in 7 stains of the transformed plants. Northern blot analyses confirmed the transcription of heavy and light chains in the transgenic plants. CONCLUSION: The successful establishment of 3G1MH transgenic Arabidopsis thaliana plants pave the way for further research on expressing therapeutic antibody in transgenic plants.
[Keywords]Hantaan virus; chimeric antibody; transgenic plants; plantibody
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus, HV)感染引起的急性病毒性传染病, 流行于世界很多国家和地区。全世界90%以上的HFRS病例发生在我国, 疫情非常严重, 年发病率超过10万人, 且以青壮年居多, 死亡率约5%～10%, 已成为我国目前死亡人数最多的急性病毒性传染病之一[1]。对于HFRS的治疗, 临床上主要是采取血液透析等方法进行对症处理。因此研究开发特异、 有效的治疗药物, 对于肾综合征出血热的临床治疗具有重要意义。本研究在前期工作的基础上[2], 将抗HTNV鼠源性单克隆抗体(mAb)3G1进行人源化改造, 并进一步将其转入模式植物拟南芥内表达, 以探索一条大规模廉价生产免疫治疗抗体的新途径, 为开发新一代特异治疗HFRS的生物制剂奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli DH5α均由第四军医大学微生物学教研室保存, 3G1MHpCAMBIA2301为抗汉滩病毒鼠/人植物表达抗体重组质粒, 由第四军医大学微生物学教研室构建; 农杆菌GV3101由西安文理学院生命科学系罗雯博士馈赠。限制性内切酶、 Taq DNA聚合酶等主要分子生物学试剂购自TaKaRa公司和MBI公司; 植物基因组DNA提取试剂盒、 植物Total RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品; 地高辛DNA标记试剂盒、 地高辛杂交检测试剂盒为依诺金公司产品。
1.2 方法
1.2.1 3G1MHpCAMBIA2301质粒转化农杆菌 通过TSS冻融法将重组植物表达质粒3G1MHpCAMBIA2301转化农杆菌GV3101感受态细胞[3], 涂于含利福霉素(50 mg/L )、 卡那霉素(50 mg/L)的LB选择培养基, 阳性菌落提取质粒, Hind III和EcoR I酶切鉴定; 同时提取质粒做PCR鉴定, 根据抗汉滩病毒鼠人嵌合抗体MHHL基因序列设计引物Ⅰ: 5′TCTCCCAAATTCATGTCC3′, 3′AGATGCGGACGCTTCAGT5′。用引物Ⅰ进行PCR反应, 反应体系: 10×PCR Buffer 2.5 μL, Primer5′1 μL, Primer3′1 μL, dNTP 1 μL, MgCl21.5 μL, Taq DNA Polymerase 0.5 μL, 质粒DNA 1 μL, H2O 16.5 μL, 总体积25 μL。PCR扩增条件: 94℃ 1 min, 52℃ 1 min, 72℃ 2 min, 35个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测目的条带, 获得含质粒3G1MHpCAMBIA2301的阳性农杆菌。
1.2.2 农杆菌介导法转化拟南芥 将野生型拟南芥种子播种于盛满蛭石培养基(营养土与蛭石体积1∶1)的营养钵中, 用保鲜膜覆盖, 萌发2～3 d后移至光照培养箱中培育, 条件: 温度23℃, 湿度70%, 日光照16 h, 培育植株至生出顶生花序, 去除顶生花序以刺激腋生花序的生长, 待其花序露白做转化用。转化农杆菌的准备: 将上述含质粒3G1MHpCAMBIA2301的阳性农杆菌, 按密度1×107/L接种于1 L LB培养基 (含50 mg/L的利福霉素和卡那霉素) 中; 28℃, 200 r/min振荡培养过夜, 至A600为1.2～1.6; 5000 r/min离心15 min, 弃上清, 农杆菌沉淀重悬于1 L转化液(0.5×MS营养液; 50 g/L蔗糖; 1×Vb5有机培养基1 mL; 0.044 mol/L 6BA; 50 μL Silwet77; 用0.4 mol/L NaOH 调pH至5.8)后置于玻璃瓶。将上述培育好的植株浸入含转化农杆菌的玻璃瓶中, 抽真空, 维持0.05 MPa压力5 min。取出种植盆, 避光侧放24 h, 然后将种植盆直立[4]。置于光照培养箱中培育植株至收获T0代成熟种子, 室温干燥存放7～14 d。
1.2.3 转化子的筛选 将转化后的拟南芥T0代种子用700 mL/L的乙醇浸泡2 min, 100 g/L 的NaClO溶液洗涤15 min, 无菌水冲洗3～5次后, 再用1 g/L的琼脂重悬种子, 将种子均匀散布于含50 mg/L卡那霉素的MS固体选择培养基 (1×MS salt, 30 g/L蔗糖, pH5.8, 7.8 g/L琼脂)上, 置23℃光照16 h培养。生长1周后挑选绿色阳性植株转至常规的MS培养基中, 10 d后转入蛭石中培养。
1.2.4 转基因植株的PCR检测 用QIAGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取植物叶片微量DNA, 根据抗汉滩病毒鼠人嵌合抗体MHHL基因序列设计引物Ⅱ: 5′GCAGGAGTCTGGGGAAGGTTTAGTA3′, 3′CTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGG5′, 以提取的植物叶片微量DNA为模板, 用引物Ⅱ进行PCR, 反应条件同方法1.2.1, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
1.2.5 Northern blot 按DIG DNA标记试剂盒Ⅰ(依诺金, 深圳)操作手册分别标记重链及轻链探针, 重链探针合成所用引物为引物Ⅱ, 轻链探针合成所用引物为引物Ⅰ; 用QIAGEN公司的植物RNA提取试剂盒提取拟南芥叶片RNA; 取10 μL经含甲醛的琼脂糖凝胶电泳后转膜[5], 分别用地高辛标记的重链及轻链探针进行Northern blot, 按地高辛杂交检测试剂盒Ⅱ(依诺金, 深圳)操作手册进行检测。
2 结果
2.1 3G1MHpCAMBIA2301质粒转化农杆菌的鉴定 通过TSS法将重组质粒3G1MHpCAMBIA2301转入农杆菌GV3101中, 提取质粒经EcoR I及Hind III双酶切得到预期2000 bp及2600 bp的条带(图1)。同时提取质粒做PCR鉴定, 转化菌质粒DNA可扩增出562 bp的片段(图2), 与阳性对照一致, 说明3G1MHpCAMBIA2301已成功转入农杆菌GV3101中。
图1 农杆菌转化子的酶切鉴定(略)
Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of transformed Agrobacterium tumefaciens
1: 3G1MHpCAMBIA2301 positive clone; 2: DNA marker.
图2 农杆菌转化子的PCR鉴定(略)
Fig 2 PCR analysis of transformed Agrobacterium tumefaciens
1: 3G1MHpCAMBIA2301 positive clone; 2: Negative control; 3: 3G1MHpCAMBIA2301 plasmid control; 4: DL 2000 marker.
2.2 转基因拟南芥的筛选 选择培育后获得转基因拟南芥植株。从其叶片中提取微量DNA, PCR鉴定, 可扩增出750 bp左右片段(图3), 表明3G1MHpCAMBIA2301基因已整合到拟南芥染色体中。
图3 转基因拟南芥植株PCR鉴定(略)
Fig 3 PCR analysis of transformed plants DNA
1-5, 8: Genomic DNA of positive transformed plants; 6, 7: Genomic DNA of negative transformed plants; 9: genomic DNA of untransformed plants; 10: Positive control of 3G1MHpCAMBIA2301; 11: NTC; 12: DL 2000 marker.
2.3 Northern blot 用重链及轻链探针分别与提取到的7株阳性植株的总RNA进行Northern blot, 以检测重链及轻链的转录情况。与重链探针杂交的样本中, 1、 2、 4、 5、 6、 8号植株可见1.5 kb左右的条带, 大小与重链相符, 野生型植株无此条带, 且以1、 2号植株转录量较高(图4)。与轻链杂交的样本中, 1、 2、 4、 6、 7号植株可见800 bp左右的条带, 大小与轻链相符, 野生型植株无此条带, 且以1、 2、 4号植株转录量较高(图5)。
图4 重链探针Northern blot分析转基因植株RNA(略)
Fig 4 Northern blot analysis of transgenic plants RNA by heavy chain probe
1, 2, 4, 5, 6, 8: Heavy chain gene transcription positive transformed plants; 3: Untransformed plant; 7: Heavy chain gene transcription negative transformed plants.
图5 轻链探针Northern blot分析转基因植株RNA(略)
Fig 5 Northern blot analysis of transgenic plants RNA by light chain probe
1, 2, 4, 6, 7: Light chain gene transcription positive transformed plants; 3: Untransformed plant; 5, 8: Light chain gene transcription negative transformed plants.
3 讨论
HFRS作为一种严重危害人类健康的传染病, 其治疗上尚缺乏特异、 有效的药物, 对于传统的抗HTNV鼠源性mAb, 虽然有较好的抗病毒作用[6], 但应用于人体存在可能产生抗鼠抗体的问题, 而人源性mAb由于存在制备困难、 产量低的问题, 也难以广泛应用。本研究在前期工作基础上通过基因工程技术, 将具有高中和活性、 高血凝抑制活性的抗HTNV mAb 3G1进行人源化改造, 所构建出的鼠/人嵌合抗体不仅有可能克服鼠源性mAb及人源性mAb的缺点, 同时, 仍然具有高中和活性及血凝抑制活性, 有望在体内外抑制或阻断病毒感染。
运用合适的植物表达系统表达基因工程抗体已成为一种前景较为广阔的研究手段, 近年来该领域的研究成为热点[7]。与原核及其他真核表达系统相比, 利用植物表达抗体有其独特的优越性: 高表达量[8]、 低成本、 外源抗体基因片段可以整合进染色体中稳定遗传, 同时对植物的生长没有影响, 植物细胞可以对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和后期加工, 其表达产物还能保持良好的生物学特性。本研究所表达的抗体为全长抗体, 用植物系统表达能有效地组装轻链和重链, 形成完整的抗体分子。另外所构建的鼠/人嵌合抗体基因含有信号肽和定位肽序列, 可以控制植物抗体基因的定向表达和储存, 以提高抗体的产量。
在农杆菌介导的遗传转化过程中, 农杆菌的培养及植物的转化条件都直接影响其转化效率, 研究中发现, 农杆菌每做一次转化必须把保存的菌种在LB选择培养基上划线接种, 并置28℃黑暗中培养48 h。所挑选的单克隆在液体培养基中培养, 其温度及转速需要严格控制, 温度高于28℃可能会引起质粒丢失, 而温度过低或转速低于250 r/min, 农杆菌生长缓慢, 耗时较长。而且每次转化植物所用农杆菌需重新转化, 否则其效率都会降低。在转化植株的过程中, 虽然使用表面活性剂Silwet77可以提高转化效率, 但有报道称该物质对植株有毒性作用, 其浓度应根据转化苗的强弱而定[9], 本研究中该表面活性物质的使用浓度为50μL/L, 低于报道的200μL/L, 取得了良好的转化效果。在真空抽滤转化时, 重复抽滤1次可提高其转化效率, 但每次真空抽滤的时间不宜过长, 超过15 min则不利于转化。
本研究将改构的鼠/人嵌合抗体基因导入植物内, 得到10株有目的基因整合的植株, 其中7株有目的基因的转录。该7株阳性植株中, 4株转录完整抗体基因, 且转录量较高, 3株转基因植株虽有目的基因的整合, 却无mRNA的转录, 这也许是由于外源基因整合到植物基因组上的位点不同, 影响mRNA的转录有关。抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体的转基因植株的成功构建, 为进一步利用植物表达治疗性抗体奠定了基础。
【参考文献】
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[2] 赵咏梅, 罗 雯, 吴兴安, 等. 抗汉滩病毒鼠源单抗3G1单链抗体转化拟南芥的研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2006, 20(7): 613-616.
[3] 罗 雯, 刘 阳. 根癌农杆菌转化条件优化的研究[J]. 生物技术, 2006, 16(1): 41-43.
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